50 Sắc Thái Là The Loại Phim Gì

Bảng xếp hạng Top 50 Doanh nghiệp Xuất sắc Việt Nam năm 2024

ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRONG Y HỌC

Kỹ thuật sắc ký là một công cụ có giá trị trong hóa sinh, bên cạnh đó nó có thể được áp dụng dễ dàng trong thời gian nghiên cứu được thực hiện trong các phòng thí nghiệm lâm sàng. Ví dụ, sắc ký giấy được sử dụng để xác định một số loại đường và acid amin trong chất dịch cơ thể có liên quan đến rối loạn chuyển hóa di truyền. Sắc ký khí được sử dụng trong các phòng thí nghiệm để đo steroid, barbiturat và lipid. Kỹ thuật sắc ký cũng được sử dụng trong việc tách vitamin và protein và đặc biệt là định lượng HbA1c.

Mục tiêu của quản lý bệnh đái tháo đường là duy trì nồng độ Glucose huyết tương trong hoặc gần ngưỡng cho phép.

Hemoglobin glycosyl hóa là thuật ngữ được sử dụng để mô tả sự hình thành hợp chất hemoglobin được tạo ra khi glucose (một loại đường khử) phản ứng với nhóm amin của hemoglobin (một loại protein). Phân tử glucose gắn không cần enzym vào phân tử hemoglobin để tạo thành một ketoamin. Tốc độ hình thành tỷ lệ thuận với nồng độ glucose huyết tương. Tế bào hồng cầu trung bình sống khoảng 120 ngày, mức hemoglobin glycosyl hóa tại thời điểm bất kỳ sẽ phản ánh mức glucose huyết tương trung bình từ 2 đến 3 tháng trước đó. Do đó, định lượng hemoglobin glycosyl hóa sẽ cung cấp thông tin về nồng độ glucose huyết tương trung bình trong 3 tháng trước của bệnh nhân giúp các bác sỹ lâm sàng quản lý bệnh nhân đái tháo đường tốt nhất.

Bảng 2. Mức tương quan giữa nồng độ glucose huyết tương và HbA1c

Hemoglobin AC (HbA1c), hemoglobin glycosyl hóa phổ biến nhất, được tạo ra do phân tử glucose gắn với một hoặc tất cả các vị trí N-terminal caline của chuỗi B polypeptid ở hemoglobin ở người lớn bình thường. HbA1c là một phương pháp đáng tin cậy hơn để theo dõi kiểm soát bệnh đái tháo đường lâu dài hơn so với glucose huyết tương ngẫu nhiên. Sử dụng mô hình hồi quy tuyến tính, Rohlfing và cộng sự xác định rằng cứ 1% thay đổi trong giá trị HbA1c, có sự thay đổi 35 mg/dL (2 mmol/L) trong glucose huyết tương trung bình (Bảng 11.1). Tuy nhiên, thông tin này cần được sử dụng cẩn trọng, vì trong nghiên cứu gần đây cho thấy mối liên quan giữa nồng đồ glucose huyết tương và HbA1c có thể thay đổi khác nhau phụ thuộc vào kiểm soát glucose máu của quần thể nghiên cứu. Hai yếu tố quan trọng cần lưu ý để xác định mức độ HbA1c: nồng độ glucose huyết tương và đời sống của hồng cầu. Nếu hồng cầu có đời sống ngắn vì các tình trạng bệnh lý khác nhau như bệnh lý về hemoglobin thì giá trị HbA1c sẽ thấp hơn.

Hiệp hội Đái tháo đường của Mỹ ADA (American Diabetes Association) khuyến cáo cần xét nghiệm HbA1c ít nhất 2 lần/năm với những bệnh nhân đái tháo đường giúp đạt được các mục tiêu điều trị và ổn định glucose huyết tương. Những bệnh nhân cần thay đổi điều trị hoặc không đạt mục tiêu điều trị, xét nghiệm HbA1c cần thực hiện 4 lần/năm. Giá trị HbA1c dưới 7% giúp giảm thiểu các biến chứng tim mạch, mắt và thận của bệnh đái tháo đường.

Định lượng HbA1c yêu cầu mẫu máu toàn phần trong ống chống đông bằng EDTA. Các phương pháp phân tích được chia thành 2 nhóm chính: (1) dựa trên sự khác biệt về điện tích giữa hemoglobulin glycosyl hóa và hemoglobulin không được glycosyl hóa (sắc ký trao đổi cation, điện di hoặc điện di tập trung đẳng điện) và (2) đặc điểm cấu trúc của nhóm glyco trong hemoglobin (sắc ký ái lực, miễn dịch và enzym).

Trong phương pháp sắc ký ái lực, hemoglobin được glycosyl hóa sẽ gắn với nhóm boronate của resin và rửa giải chọn lọc bằng dung dịch đệm. Phương pháp này không phụ thuộc vào nhiệt độ và không bị ảnh hưởng bởi hemoglobin S, F và C. Phương pháp khác được sử dụng là sắc ký trao đổi cation, trong đó các hemoglobin tích điện dương sẽ gắn vào các giường resin tích điện âm. Hemoglobin được glycosyl hóa được rửa giải chọn lọc từ giường resin bằng các dung dịch đệm có pH đặc biệt. Tuy nhiên, phương pháp này phụ thuộc vào nhiệt độ và bị ảnh hưởng bởi các bệnh lý về hemoglobin. Sự có mặt của hemoglobin F sẽ dẫn đến tăng HbA1c giả tạo, sự có mặt của hemoglobin S và C sẽ dẫn đến giảm HbA1c giả tạo. Phương pháp HbA1c trên thiết bị POCT dựa trên phương pháp ức chế ngưng kết miễn dịch latex, cả nồng độ HbA1c và tổng nồng độ hemoglobin đều được định lượng, và tỷ số được báo cáo là HbA1c. Trong phương pháp này, glycohemoglobin F sẽ không được đo, vì vậy nếu hemoglobin F cao (> 10%) thì lượng HbA1c sẽ thấp hơn dự kiến do kết quả bị nhiễu bởi hemoglobin F. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và điện di thường được sử dụng để phân tách các dạng khác nhau của hemoglobin. Với phương pháp HPLC, tất cả các dạng của hemoglobin được glycosyl hóa như A1a, A1b, và A1c đều được phân tách.

Việc chuẩn hóa cho xét nghiệm HbA1c tiếp tục gặp nhiều khó khăn, không có một sự đồng thuận về phương pháp tham chiếu và không có tiêu chuẩn đơn giản vào sẵn có sử dụng cho phương pháp đánh giá này. Giá trị HbA1c có thể thay đổi theo phương pháp và thực hành phòng xét nghiệm. Liên đoàn quốc tế về Hóa học lâm sàng và Phòng thí nghiệm y học IFCC đã phát triển một khái niệm chung cho HbA1c và một phương pháp tham chiếu đặc biệt giúp đo lường chỉ 1 loại phân tử A1c glycosyl hóa. Phương pháp này sử dụng HPLC khối phổ (HPLC/MS) hoặc HPLC điện di mao quản (HPLC-CE), chỉ sử dụng để chuẩn hóa HbA1c và không sử dụng để đo lường HbA1c trên lâm sàng. Gần đây, các nhóm đồng thuận quốc tế đã xác nhận rằng các kết quả HbA1c sẽ được công nhận trên toàn thế giới với đơn vị mmol/mol của IFCC và đơn vị % của Chương trình chuẩn hóa Glycohemoglobin quốc gia NGSP, sử dụng thuật toán quy đổi IFCC-NGSP [NGSP(%) = 0,09148 IFCC (mmol/l) + 2.152]. Nhà sản xuất thiết bị và hóa chất HbA1c được yêu cầu cung cấp các hồ sơ truy nguyên nguồn gốc đối với hệ thống tham chiếu IFCC với đơn vị mmol/mol (IFCC) và đơn vị dẫn xuất % (NGSP). Với những phát triển này, các phép đo HbA1c sẽ trở thành một chỉ số đáng tin cậy hơn giúp kiểm soát lượng glucose trong máu ở bệnh nhân đái tháo đường, mang tính nhất quán hơn về các kết quả giữa các phòng xét nghiệm.

Không ảnh hưởng bởi các hemoglobin khác

Ảnh hưởng bởi các bệnh lý về hemoglobin

Loại điện di sử dụng điểm đẳng điện để phân tách

Phân tách được tất cả các dạng hemoglobin glycosyl hóa: A1a, A1b, A1c.

Phương pháp miễn dịch, enzym đã được mô tả kỹ ở bài trước. Phần này tập trung chủ yếu phân tích phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với nhiều ưu điểm và sử dụng phổ biến hiện nay.

a. Nguyên lý hoạt động: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một dạng sắc ký lỏng cột được cải tiến, thay vì dung môi chảy dưới áp suất của trọng lực, dung môi chảy với áp suất cao lên tới 400 atm, làm tăng tốc độ chảy của dung môi pha động. HPLC hoạt động với nguyên tắc cơ bản: tách một mẫu gồm hỗn hợp thành phần thành các bộ phận cấu thành của nó dựa trên sự khác biệt về ái lực giữa các phân tử khác nhau với pha động và pha tĩnh được sử dụng trong quá trình tách.

Trong các máy HPLC dùng để định lượng HbA1c thường sử dụng phương pháp HPLC trao đổi ion. Pha tĩnh được phủ bởi các ion có điện tích trái dấu với ion trong mẫu. Pha động là các dung dịch đệm được kiểm soát pH và cường độ ion. Mẫu máu toàn phần được bộ tiêm mẫu đưa vào hệ thống, pha động gồm các chất rửa giải được bơm qua mẫu. Các tế bào hồng cầu được ly giải (pha động) sẽ được đi qua một lớp resin tích điện âm phủ lên bề mặt của cột HPLC (pha tĩnh). Các phân từ hemoglobin tích điện dương sẽ liên kết với các resin tích điện âm, vì vậy, các phân tử tích điện âm sẽ đi nhanh hơn. Các hemoglobin liên kết được giải phóng bởi các điều kiện dung môi khác nhau được bơm vào cột (ví dụ tăng hiệu ứng ion của hệ thống dung môi bằng cách tăng nồng độ muối của dung môi, tăng nhiệt độ cột, thay đổi pH của dung môi,...). Một sắc ký đồ thể hiện các thành phần rửa giải dưới dạng các đỉnh peak.

Trong phương pháp này đặc biệt chú ý đến chất lượng, loại và kích thước của hạt resin sử dụng trong cột. Vật liệu resin không xốp đã được chứng minh là một loại vật liệu cột hiệu quả trong phân tích HbA1c. Đối với máy sử dụng phương pháp HPLC phân tích HbA1c, ví dụ như máy Tosoh Automated Glycohemoglobin Analyzer HLC-723G8 sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trao đổi ion cột resin không lỗ xốp.

+ Bền vững, không bị phân hủy trong quá trình chạy sắc ký.

+ Có độ nhớt thấp và phù hợp với bộ phận detector (đầu dò tín hiệu).

Bơm dung môi là một trong những thành phần quan trọng nhất của hệ thống HPLC. Bơm dung môi được phân loại thành máy bơm áp lực không đổi và máy bơm dòng chảy không đổi. Hiệu suất của bơm ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng toàn bộ hệ thống và độ tin cậy của kết quả phân tích.

Thiết bị lấy mẫu này được yêu cầu phải có độ kín tốt, thể tích chết nhỏ, độ lặp lại tốt để đảm bảo việc tiêm mẫu hiệu quả.

Lựa chọn cột phải phù hợp với mẫu và mục đích phân tách. Cột HPLC nên duy trì nhiệt độ hằng định. Nếu nhiệt độ của cột bị thay đổi trong quá trình phân tách thì thời gian rửa giải sẽ bị thay đổi, dẫn đến kết quả phân tách không phù hợp. Nhiệt độ phân tích nên được lựa chọn dao động giữa 25 – 50°C là phù hợp.

Một số lỗi khiến sắc ký đồ bất thường: Sắc ký đồ bất thường thường đặc trưng bởi sự hiện diện 1 đỉnh không xác định, hình dạng biến dạng đỉnh, xác định sai 1 số loại hemoglobin. Cần phải xem xét các kết quả sắc ký đồ để xác định xem kết quả chính xác hay do lỗi phân tích. Sự cố do trục trặc của hệ thống như máy bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sử dụng thời gian dài hoặc thuốc thử đặt không chính xác hoặc sắp hết.

+ Sử dụng quá hạn dung dịch rửa giải.

+ Gắn nắp bình dung môi với hệ thống lỏng.

+ Hết dung dịch dung môi chưa thay thế, hút sẽ bị bọt.

+ Máy phân tích không sử dụng trong thời gian dài sẽ dẫn tới không khí có thể lọt vào trong bình dung môi dẫn đến bơm không ổn định áp suất, sắc ký đồ không xác định được loại hemoglobin. Nếu gặp trường hợp này tiến hành mồi thủ công các dung dịch rửa giải.

+ Máy đang hoạt động bị lỗi dừng máy đột ngột, mẫu vẫn còn trong cột, vì vậy, nếu để mẫu trong cột sẽ gây hỏng cột, giảm tuổi thọ của cột nên cần tiến hành rửa lại cột.

+ Nhiệt độ của cột không ổn định

+ Cần thay thế cột trong các tình huống sau:

+ Khi áp suất trong cột lớn hơn +4 Mpa và áp suất không giảm bằng cách thay thế bộ lọc.

+ Khi các peak trên sắc ký đồ bị rộng hoặc chia thành 2 phần.

+ Khi mẫu QC ngoài dải nhất quán mặc dù đã tiến hành calibration.

+ Khi lỗi calibration liên tục xảy ra.

+ Lỗi kết nối với màn hình, với máy chủ.

+ Diện tích peak quá thấp không đạt đến diện tích tối thiểu: cần kiểm tra lại

mẫu, dung môi buffer, dung dịch rửa.

Sắc ký giấy trong thực tế là một phương pháp cực kỳ đơn giản. Chỉ cần một giọt nhỏ vật liệu cần kiểm tra được đặt khoảng 5 cm từ mép của một tờ giấy lọc hình chữ nhật và được để khô ở đó. Cạnh của giấy sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp, vật chất sẽ mao dẫn lên giấy. Khi chất lỏng đi qua điểm tương ứng cho mỗi hợp chất hóa học kéo theo chất lỏng với tốc độ đặc trưng của chất đó. Bằng cách sử dụng kỹ thuật này, một hỗn hợp các chất được áp dụng cho cùng một điểm có thể được tách ra khỏi nhau trên giấy lọc trong vài giờ vì chúng di chuyển với chất lỏng ở tốc độ khác nhau.

Ví dụ: nếu hỗn hợp A, G, C và T được cho vào tại một điểm và dung môi lỏng là rượu butyl đi qua nó, bốn chất sẽ tách ra khỏi nhau trong khoảng 18 giờ. Thymine di chuyển nhanh nhất, tiếp theo là cytosine, Adenine và guanine.

Kỹ thuật sắc ký lỏng khí được sử dụng rộng rãi, đặc biệt là trong phân tích các polysaccarit trong thành tế bào thực vật và trong đo lường NSP.

Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) giúp phân tách của tất cả các monosaccarit, disaccarit và oligosaccarit. Ban đầu các cột carbohydrate chưa ổn định nhưng sau đó đã tốt hơn. Các hệ thống ban đầu sử dụng chỉ số khúc xạ nhưng chúng không nhạy lắm và các hệ thống sau này đo cường độ xung đã vượt qua nhược điểm này.